由熒光的發(fā)光原理可知，分子熒光光譜與激發(fā)光源的波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，只與熒光物質(zhì)本身的能級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，所以，可以根據(jù)熒光譜線對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行定性分析鑒別。照射光越強(qiáng)，被激發(fā)到激發(fā)態(tài)的分子數(shù)越多，因而產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，測(cè)量時(shí)靈敏度越高。一般由激光誘導(dǎo)熒光測(cè)量物質(zhì)的特性比由一般光源誘導(dǎo)熒光所測(cè)的靈敏度提高2-10倍。
當(dāng)紫外光或波長(zhǎng)較短的可見光照射到某些物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)射出各種顏色和不同強(qiáng)度的可見光，而當(dāng)光源停止照射時(shí)，這種光線隨之消失。這種在激發(fā)光誘導(dǎo)下產(chǎn)生的光稱為熒光，能發(fā)出熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)。
熒光分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)
01.樣品室：通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。測(cè)量液體時(shí)，光源與檢測(cè)器成直角安排；測(cè)量固體時(shí)，光源與檢測(cè)器成銳角安排。
02.激發(fā)單色器：置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。
03.發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測(cè)器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜。
04.光源：為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm～400nm范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用。
05.檢測(cè)器：一般用光電管或光電倍增管作檢測(cè)器?？蓪⒐庑盘?hào)放大并轉(zhuǎn)為電信號(hào)。
分子的吸收光譜和產(chǎn)生熒光的機(jī)制：
當(dāng)物質(zhì)分子吸收某些特征頻率的光子以后，可由基態(tài)躍遷至第一或第二電子激發(fā)態(tài)中各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)和各個(gè)不同轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。處于激發(fā)態(tài)的分子通過無(wú)輻射弛豫（例如，與其它分子碰撞過程中消耗能量，或者，對(duì)分子組織而言，誘發(fā)光化反應(yīng)而消耗能量等）降落至第一電子激發(fā)態(tài)的*低振動(dòng)能級(jí)，然后再由這個(gè)*低振動(dòng)能級(jí)以輻射弛豫的形式躍遷到基態(tài)中各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)，發(fā)出分子熒光。然后再無(wú)輻射弛豫至基態(tài)中*低振動(dòng)能級(jí)。
幾乎所有物質(zhì)分子都有吸收光譜，但不是所有物質(zhì)都會(huì)發(fā)熒光。產(chǎn)生熒光必須具備以下條件：
①吸收了與本身特征頻率相同的能量之后的物質(zhì)分子，必須具有高的熒光效率。許多吸光物質(zhì)并不產(chǎn)生熒光，主要是因?yàn)樗鼈儗⑺漳芰肯挠谂c溶劑分子或其它分子之間的相互碰撞中，還可能消耗于一次光化學(xué)反應(yīng)中，因而無(wú)法發(fā)射熒光，即熒光效率很低。
②該物質(zhì)分子必須具有與所照射的光線相同的頻率，這與分子的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。
